蛋(dan)白糖(tang)基(ji)化是一種非常重要的蛋(dan)白質(zhi)后(hou)修飾方式。糖(tang)基(ji)化對蛋(dan)白質(zhi)的理(li)化性質(zhi)和生(sheng)物功能都可以產生(sheng)重大影(ying)響(xiang)，生物藥分子的糖基化可能決定了其臨床效果，因(yin)此糖(tang)基化在(zai)生(sheng)物(wu)藥(yao)生(sheng)產(chan)中是一個關鍵質(zhi)量(liang)屬性，必須在(zai)開(kai)發(fa)和生(sheng)產(chan)過程中密(mi)切監視(shi)，并在(zai)工藝中特異(yi)性分(fen)離或者去除(chu)糖基化分(fen)子(zi)。近些年來，硼酸親和技術在(zai)糖蛋(dan)白純化領(ling)域得到了快速的(de)發展(zhan)，其(qi)獨特的(de)親(qin)和性(xing)引起(qi)了研究人員的(de)極大關注。由(you)于(yu)硼酸基于(yu)與順式(shi)二(er)醇基團可(ke)發生可(ke)控的(de)(de)可(ke)逆共價鍵合反(fan)應，后(hou)者在糖蛋白的(de)(de)糖鏈結構(gou)中廣泛(fan)存在，因而硼酸親和(he)技術常(chang)被用(yong)做是一種選擇(ze)性富集分(fen)離順式(shi)二(er)醇化合物的(de)(de)有(you)效提純手段。硼酸親和(he)作用(yong)的(de)(de)工作原理如下圖。

APB親和填料是由(you)Astrea Bioseparations公司推出(chu)的配基為氨基苯基硼酸鹽的親和層析(xi)填料（Aminophenylboronate，簡(jian)稱APB），特別適用于(yu)糖(tang)蛋白的純化(hua)(hua)，或(huo)從非糖(tang)基化(hua)(hua)分子中(zhong)去除糖(tang)蛋白和碳(tan)水化(hua)(hua)合物雜質，從(cong)而應對糖(tang)蛋白純化工藝中的各(ge)種(zhong)挑(tiao)戰，此外，APB填料(liao)還(huan)可用于純(chun)化和(he)去除某(mou)些酶(mei)(mei)，例如硼酸(suan)基團(tuan)對活性位點(dian)具有親和(he)性的(de)蛋白酶(mei)(mei)和(he)水解酶(mei)(mei)等(deng)。

APB親和(he)填料有兩(liang)種不同的基(ji)架可選擇，其中Aminophenylboronate P6XL采用的(de)是Astrea專有的(de)Purabead® P6XL近單分散(san)瓊脂糖(tang)微球來生產(chan)高度穩定(ding)的(de)交聯瓊脂糖(tang)基(ji)架(jia)。 Purabead®產(chan)品具(ju)有非常(chang)均(jun)勻的(de)粒徑，可在低背壓條件下實現可重現的(de)層析(xi)柱裝填(tian)和高流速(su)。因此，Aminophenylboronate P6XL 是生(sheng)物工藝應用的首選(xuan)親(qin)和填(tian)料。Aminophenylboronate A6XL是Astrea的原創產品，該填料的瓊脂糖(tang)基質具有更寬的粒度分布(bu)，更適(shi)合小規模(mo)或診(zhen)斷應用。兩種(zhong)基架(jia)都是經過優化(hua)的(de)，有相同的(de)穩(wen)定的(de)配基和偶聯物，都適(shi)用于各種(zhong)生物制品的(de)分離和純化(hua)。

APB親(qin)合填(tian)料產品特(te)點

適用(yong)于(yu)親和純化或去除糖蛋白及聚(ju)糖

高純(chun)度m-氨基苯硼酸鹽配基(ji)

配基通過順式二(er)醇(chun)選擇性結(jie)合(he)至碳水化(hua)合(he)物基團。

高動態(tai)結合載量

填料穩定(ding)性好，使(shi)用壽命長

可耐(nai)受(shou)0.5 M NaOH清潔，允許數百(bai)次循(xun)環使用(yong)

符合(he)ISO 9001標準，批次穩定性重復性好

提供全面的法規支持文件（RSF），支持GMP生(sheng)產和商業化申(shen)報

已有多個受監管(guan)的(de)生(sheng)(sheng)物制藥生(sheng)(sheng)產和醫療診斷(duan)領域用(yong)戶使用。

pH穩定性:

APB親(qin)和(he)填料在pH 3-13（連續(xu)暴露）范圍(wei)內穩定，并且可承受pH 14.0的間(jian)歇暴露。

在(zai)室(shi)溫(wen)條件下，在(zai)從pH 0.0(1 M HCl) 到pH 14.0 (1M NaOH) 的一系列測試溶液中孵育的APB A6XL的(de)pH穩定性曲線(xian)。收集上清液樣(yang)品并以連續暴露1周至1年的(de)特(te)定時間間隔(ge)測定配基(ji)的脫(tuo)落(luo)情況。

流(liu)速
APB P6XL的均(jun)勻粒徑(jing)使該吸附填料能夠(gou)在(zai)高(gao)線性流(liu)速(su)下使用。可(ke)以使用高(gao)達500 cm/h的操作流(liu)速(su)，盡(jin)管在(zai)層(ceng)析柱上樣(yang)和洗脫期間的流(liu)速(su)通常在(zai)50–200 cm/h范圍內。

APB P6XL（直(zhi)徑(jing)3.2 cm x床高15 cm）的壓力(li)-流速曲線。

結(jie)合載量
APB P6XL/A6XL對糖(tang)蛋白的結(jie)合載量(liang)范圍(wei)為10–20 μmol/g，對碳水化合物的結合載量高達(da)30 μmol/g。

操作條件
糖蛋白(bai)與APB親和填料的結合在低(di)至中等(deng)離子(zi)強度（10–300 mM）和弱堿性pH條件（pH 范圍8.0–9.5）下最佳(jia)。可以使用(yong)磷酸鹽制備的緩沖液，推(tui)薦使用硼酸鹽和甘氨酸進行柱平衡。建議結合(he)流速在50–150 cm/h之間。吸附填(tian)料的(de)結合(he)載量取決于(yu)樣品的(de)性質，對于(yu)糖蛋(dan)白來說，通常在10–20 μmol/g的(de)范圍(wei)內。

通過(guo)使(shi)用低pH緩沖(chong)液(ye)或通過(guo)使(shi)用競爭性二醇，可(ke)以從APB親(qin)和填料中(zhong)洗(xi)脫結合(he)的(de)蛋白(bai)質。可以使(shi)用(yong)pH4.0的(de)0.1 M甘氨酸(suan)(suan)/HCl或0.1 M醋酸(suan)(suan)鹽(yan)緩(huan)沖液降低pH值進行洗(xi)脫。對于(yu)酸(suan)(suan)不穩定性蛋白(bai)質，可以使(shi)用(yong)合(he)適的(de)競(jing)爭性二醇(chun)(chun)，例(li)如20–200 mM山(shan)梨醇(chun)(chun)，在(zai)中(zhong)性pH緩(huan)沖液中(zhong)進行洗(xi)脫。

APB親和填料參(can)數

應用案例

1. 用APB P6XL純化胎球(qiu)蛋白

胎球蛋白是胎牛(niu)血清(qing)中的主要59 kDa糖蛋白，含(han)有(you)三個N-鏈(lian)(lian)和O-鏈(lian)(lian)碳水化合物(wu)側鏈(lian)(lian)。該案(an)例介紹了(le)使用APB P6XL層析柱從(cong)商品化粗(cu)溶液中純(chun)化胎球蛋白。

層析色譜圖

胎(tai)球蛋白(bai)層(ceng)析條件參數：

層(ceng)析柱高度：4 cm

柱體積：3.1 mL

線性(xing)流速：50 cm/h

平衡&漂洗緩沖液：50 mM磷酸鈉，pH 9.0

洗脫：山梨(li)醇梯度(0–200mM)

消毒：1M NaOH

2. 重組糖蛋白的捕獲

APB層(ceng)析填(tian)料特別適用于糖蛋白的捕獲和純化。下圖(tu)展示了(le)一個(ge)經典的親和純化色譜圖，其中有一個(ge)大(da)的流(liu)穿(chuan)和一個(ge)小的離(li)散洗脫峰。在50 mM山(shan)梨醇洗脫后達(da)到(dao)完全的目標糖蛋白回收。

層析色譜(pu)圖(tu)

層析條(tiao)件參數：

層析柱：直(zhi)徑1.0 cmx柱床(chuang)高7.4 cm

平衡漂洗/緩沖液：50 mM甘氨酸/NaOH pH 9.0

洗脫：50 mM 磷酸(suan)鹽緩沖液，0-200 mM山(shan)梨(li)醇梯度

消毒(du)：0.5 M氫氧化鈉

流速：200 cm/h

APB A6XL純化(hua)的(de)糖蛋白(bai)Western blot結(jie)果圖（泳(yong)道1 分子(zi)量marker，泳(yong)道2 上樣到APB A6XL的(de)樣品，泳(yong)道3 流穿液，泳(yong)道4-8 梯度洗脫液）

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Aminophenylboronate P6XL

Aminophenylboronate A6XL