前言

HCP ELISA檢測方法必須要(yao)通過法規認(ren)可的(de)實驗方法（ICH或FDA指南等）進行方法(fa)學驗證(zheng)，以確保其能夠產(chan)生準確的結果。想要獲得準確(que)的(de)HCP ELISA檢測結果，本質上是要保證樣品中HCP的濃度(du)高于試劑盒的定量下(xia)限(xian)（LOQ），同(tong)時HCP的檢(jian)測抗體還要處于(yu)過剩狀態(tai)，滿足這兩點就必須要對檢測(ce)樣品（過程樣品和最終的(de)藥物原液(ye)）進行稀釋(shi)線性驗證(zheng)。因(yin)此(ci)，稀釋線性(xing)（dilution linearity）是驗證(zheng)HCP ELISA方法特異性(xing)和(he)準(zhun)確性(xing)的關鍵實驗之一。在(zai)HCP檢測中，稀(xi)釋(shi)線(xian)性不佳的原因主(zhu)要有兩種(zhong)(zhong)：一種(zhong)(zhong)是樣品中某(mou)些HCPs的抗體過剩條件不(bu)滿足，需要通過進(jin)一步稀釋來達到“最小必要(yao)稀釋倍數”（MRD）；另一(yi)種(zhong)是(shi)產(chan)(chan)品蛋白(bai)本(ben)身(shen)或產(chan)(chan)品配方緩沖液中的某些成分對HCP的檢測產(chan)(chan)生干擾，可以(yi)采用(yong)指定的樣品(pin)稀釋液（見文(wen)末）或(huo)者緩沖液置換(huan)等方式處(chu)理樣品(pin)來滿足檢測需求。關于樣品(pin)稀釋(shi)(shi)液，最優(you)的選擇是使用和標準品(pin)相(xiang)同(tong)的稀釋(shi)(shi)液。Cygnus針對(dui)每種ELISA檢測方法都(dou)提供了相(xiang)應的樣品(pin)稀釋(shi)(shi)液，以確(que)保(bao)檢測結果的準確(que)性和可重復(fu)性。對于使用Cygnus HCP ELISA試劑盒(he)的用戶，我(wo)們建(jian)議(yi)將(jiang)可接受(shou)的稀釋線性定義(yi)為“在兩倍稀釋時，校正后(hou)的HCP濃(nong)度變(bian)化不超(chao)過±20%”。同(tong)時，還要避免(mian)檢測值靠(kao)近定量下限，即(ji)稀釋樣品(pin)HCP檢測(ce)值不能低于(yu)定量下限(xian)的(de)兩倍。接下來，本(ben)文將為您詳細解讀HCP ELISA方法學驗(yan)證中有關線性稀(xi)釋的(de)操作方法與注意事項。

為什么(me)要(yao)建立(li)稀釋線(xian)性？

在(zai)測(ce)試一(yi)個新的(de)宿主細(xi)胞蛋白(bai)（HCP）ELISA方法時，建立稀釋線性是第一項基礎(chu)實(shi)驗，目(mu)的是確(que)認所選(xuan)擇的HCP ELISA是否(fou)適用于您的過程樣(yang)品和藥物原(yuan)液中的HCPs。當稀(xi)釋(shi)線(xian)性確認(ren)后(hou)，它將為(wei)進一步(bu)的分(fen)析驗證提(ti)供所需的(de)實(shi)驗條件(jian)信(xin)息(xi)，因此稀(xi)釋線(xian)性(xing)通常是最先進行的(de)驗證(zheng)實驗。

具體來講，稀釋線性(xing)實驗(yan)的目的是確定ELISA方法對(dui)樣品(pin)中HCPs的反應曲線(xian)和全定量范圍。成功(gong)驗證(zheng)了稀釋線(xian)性意味(wei)著對存在(zai)于(yu)該樣(yang)品中的各種HCPs，抗(kang)體過剩(sheng)條件已滿足，且樣品基質不會影(ying)響HCP的定量(liang)，從而保證HCP ELISA檢測(ce)結(jie)果(guo)的可靠性(xing)。

如何進行稀釋線性實驗？

在進(jin)行ELISA分(fen)析之(zhi)前，任何(he)可能超過定量(liang)上限（ULOQ）的樣品都應該先進行稀釋線(xian)性實驗。其過程包括：用驗證過的樣(yang)品稀釋液對HCP待檢樣(yang)品進行多個(ge)梯度(du)稀釋，然后對這(zhe)些(xie)稀釋樣品(pin)進行檢測，并計算每個稀釋樣品中(zhong)校正后(hou)的HCP濃度（即測(ce)得的HCP濃度×稀釋倍數）。大多數情況下(xia)，在(zai)達到(dao)一定稀釋(shi)倍數后，稀釋(shi)樣品校正(zheng)后的(de)HCP濃(nong)度值會出現相對恒定狀態，那(nei)么該稀釋倍(bei)數則被稱為“最低需(xu)求稀釋度”（MRD）。

圖1 最低需求稀(xi)釋度（MRD）

如(ru)下表案例(li)，樣(yang)品在高濃度（未稀釋(shi)和1:2，1:4稀釋(shi)）時并未(wei)顯(xian)示(shi)出良(liang)好(hao)的稀(xi)釋線(xian)性，但隨著進(jin)一步稀(xi)釋，我們可以確定(ding)一個MRD，即(ji)在此稀(xi)釋度實現了可(ke)接受的稀釋線性(xing)（見下表藍色行）。按照定義(yi)，當(dang)校正后的HCP濃(nong)度(du)在2倍(bei)稀釋之(zhi)間的變化(hua)范圍不超過(guo)±20%時，即(ji)達(da)到了可接(jie)受(shou)的稀釋線(xian)性，同時還要避免(mian)靠近(jin)定量下(xia)限，即稀釋樣品HCP檢測值不能低于定(ding)量下限的兩(liang)倍（在這個案(an)例中1:64稀(xi)釋(shi)樣品HCP檢測值＜2倍LOQ，因此未計入統計）。變化百分比可以通(tong)過減去前一(yi)稀釋樣品濃度的(de)校正(zheng)值(zhi)，然后將差值(zhi)再除以前一個稀釋樣(yang)品濃度(du)的校(xiao)正(zheng)值來計算。例(li)如(ru)，1:2稀釋樣品相(xiang)較(jiao)未(wei)稀釋樣品的變化百分比(bi)為：[(233-146)/146]x100%=60%。

從表中數(shu)據我們可以得出結論(lun)，該樣(yang)品的MRD為1:4，那么最終計算出HCP的濃度應在MRD以(yi)(yi)下（或等(deng)于）和LOQ以(yi)(yi)上所(suo)有校正后HCP濃度的平均值（在(zai)此(ci)例中，應(ying)取312、361、356和370的平(ping)均值(zhi)即350ng/mL）。

在實際應用中，我(wo)們(men)應當(dang)對(dui)需要(yao)檢測(ce)HCP的(de)所有樣品類型（包括過程(cheng)樣品以及最終的藥物原液）進行稀(xi)釋線(xian)性(xing)的(de)評(ping)估，并將每種樣品類型和基(ji)質的MRD值以及稀(xi)釋不同樣品的(de)具體指導納(na)入(ru)到(dao)SOP文件中。

稀釋線性(xing)不佳的原因與解決方法

對于HCP ELISA檢測(ce)，可能會出現某些HCPs稀釋線性(xing)不佳的情況，也就是樣品中存在某些(xie)HCPs的(de)抗體過剩條(tiao)件未被滿(man)足。例如(ru)，個別高濃度(du)的HCP可能對(dui)該特定HCP的抗體(ti)產生飽和，出現(xian)了“鉤子效應（high-dose hook effect）”，從而導致(zhi)該HCP的定量不準(zhun)確(que)。

圖(tu)2 鉤(gou)子效應(ying)（high-dose hook effect）示意圖

此外，某(mou)些伴隨(sui)蛋白（hitchhiker proteins）可能會(hui)與(yu)產物蛋白相互作用，并在純(chun)化過程中顯著富集，從而完(wan)全(quan)干擾整個分析的(de)線性。

圖3. 伴隨蛋白（hitchhiker proteins）與(yu)產物蛋白相互作用干擾分析線性

其他導致稀釋線(xian)(xian)性不(bu)佳的原(yuan)因還有(you)可能(neng)是產(chan)品配(pei)方（或(huo)過(guo)程樣品的(de)緩(huan)沖溶(rong)液）中的某些成分干擾了檢(jian)測(ce)，對于Cygnus HCP ELISA試劑盒，已知的干擾因(yin)素包括極端pH、洗滌(di)劑、有機溶劑、高蛋白濃度和(he)高鹽(yan)濃度等，因此我們建議(yi)樣品的稀(xi)釋一定要(yao)使用和標準(zhun)品(pin)相同的稀釋(shi)液，詳見(jian)下表。

Cygnus不(bu)同生物工藝雜質檢(jian)測試劑(ji)盒對(dui)應的樣品稀釋液一(yi)覽

最后，我(wo)們(men)再次(ci)強調，只有在抗(kang)體(ti)過剩的情況下(xia)，劑量反應曲線(xian)才會(hui)呈正斜率，檢測(ce)結(jie)果才是準確的。

如(ru)果稀釋線(xian)(xian)性(xing)不佳的因(yin)素是由HCP抗體(ti)不足(zu)或樣品基(ji)質干擾，那(nei)么隨著樣品的稀(xi)釋(shi)倍數(shu)增加，其測得的HCP濃度會呈現(xian)上升趨勢(shi)，因此需要通過進一(yi)步稀(xi)釋樣品來達到MRD。如果是其他(ta)原(yuan)因，也可以通過(guo)優化實驗步驟來提高(gao)檢測的(de)準確性。如果(guo)增加樣品的稀釋(shi)倍(bei)數仍無法解決稀釋線性不佳的問(wen)題，則(ze)有可(ke)能是純化過(guo)程存在問題。

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