蛋(dan)白類(lei)藥物(wu)如單克隆抗體(ti)和抗體(ti)偶(ou)聯藥物(wu)因(yin)具(ju)有極佳(jia)的治療效果與(yu)靶向(xiang)作用(yong)正以(yi)火箭般的速(su)度飛速(su)發展，但這些藥物(wu)為患者(zhe)帶(dai)來健康的同時，也(ye)為藥品研(yan)發人員帶(dai)來更(geng)大的壓力。因(yin)其在諸多環(huan)境暴露下(xia)的不穩(wen)定性(xing)，需要制藥科學家們對藥物(wu)質量(liang)進行持續監(jian)控，以(yi)滿足生產和臨床需要。蛋(dan)白(bai)質在制備，生產和運輸(shu)存儲過(guo)程中可能(neng)面對著(zhu)如凍融(rong)，高溫和震蕩的(de)多(duo)重(zhong)壓力，隨之而來的(de)是(shi)對蛋(dan)白(bai)聚(ju)集體增多(duo)的(de)擔憂。蛋(dan)白聚集(ji)會影響藥物安全，嚴重的蛋白聚集還(huan)可能增加對患者(zhe)的免疫源性(xing)風險。令人欣慰的(de)是，分子排阻色譜法(fa)作為(wei)監控蛋白類藥(yao)物聚(ju)集體的(de)有效檢(jian)測手段已經成為一(yi)項金(jin)標準(zhun)。我們使用ZF-LC-0001分子(zi)排阻色譜（SEC-HPLC）通(tong)用流(liu)動相(xiang)對單克隆抗(kang)體與抗(kang)體偶聯藥(yao)物進(jin)行分析,獲得了令人(ren)非常滿意的效果。

目前SEC-HPLC方法已經標(biao)準化，研究(jiu)人員(yuan)可以根據蛋白分(fen)子量選擇標準(zhun)的商業(ye)化色譜柱(zhu)進行定量分(fen)析(xi)，但(dan)流動相的選擇通常依(yi)賴經驗。這些流動相一(yi)般為含鹽的水溶液，調配到一(yi)定(ding)的pH值(zhi)后再進(jin)行分析(xi)。然而含鹽流(liu)動(dong)相在SEC-HPLC分析過程中會(hui)面臨容易長菌(jun)的問題，雖然在(zai)流動相(xiang)中加(jia)入(ru)0.5-1M氯化鈉(na)會產生一定的抑菌(jun)效果，但效果有限且可(ke)能帶來鹽析堵塞(sai)儀器的(de)風險。部分研(yan)究人員(yuan)還會選擇在流動相中(zhong)加入少許(xu)疊氮化鈉來抑制(zhi)細菌生長，但隨著化學品監管(guan)逐(zhu)漸嚴格，這項手段也成為不可(ke)能。在蛋白(bai)藥(yao)物研發階段，如預制劑(ji)處方開(kai)發階段，往(wang)往(wang)需要進行(xing)多處方篩選設計與全面(mian)的(de)應力(li)實驗，這些(xie)應力(li)實驗包括高溫、凍融、光照與振蕩，實驗的(de)全面(mian)設計會帶來分析量(liang)的(de)增加(jia)，如一次頭碰頭SEC-HPLC分析會大于200個(ge)樣本(ben)（N=3），這使得液相分(fen)析的時(shi)間大于4天。通常(chang)，一(yi)個序列的(de)分析中間不可以中斷，若意外中斷會帶來(lai)新的(de)校準和系統平衡，且(qie)中斷前的(de)數據仍(reng)需要(yao)進行質(zhi)量保證評估才可以使用。為了解(jie)決這一(yi)問題，舟帆生物新推出(chu)了一款SEC-HPLC通(tong)用流動(dong)相（貨號：ZF-LC-0001），可以滿足(zu)樣品的(de)持續分(fen)析，常(chang)規條件下(xia)十天之內不(bu)會(hui)影響(xiang)分(fen)析。

1. SEC流動相抑菌效(xiao)力對比(bi)

按(an)照(zhao)常規(gui)配方進行配比制備本次實驗(yan)所用不含舟帆(fan)生(sheng)物特有配方流動相。分別將(jiang)對照(zhao)組與 ZF-LC-0001流動相（1×）罐裝至干(gan)凈透透明的1L流動相瓶中，分(fen)別于0, 1, 2, 5, 10天時拍照(zhao)留樣，記錄圖片如圖1所示。與(yu)對照組流動相(xiang)相(xiang)比，ZF-LC-0001流動相(xiang)顯(xian)示(shi)出優異的抗菌效力。結果(guo)顯(xian)示(shi)對照組流動相(xiang)于(yu)第1天即出現肉(rou)眼可見異物，并(bing)于第2天現象(xiang)加重，第5天(tian)取(qu)樣與第(di)10天取樣拍照后發現(xian)兩者狀(zhuang)態相似(si)。ZF-LC-0001流(liu)動相直至第10天(tian)仍然保持清澈透明(ming)。此留樣階段的(de)流動相被用于(yu)后面實驗的(de)分析。

圖1. 常規(gui)流動相(xiang)與(yu)舟帆生(sheng)物(wu) ZF-LC-0001 流動相抑(yi)菌(jun)效力對比

2. 日內(nei)精密(mi)度(du)與(yu)日間(jian)精密(mi)度分析

使用ZF-LC-0001在常規分析環境下放置10天后的流動相，對重(zhong)組抗人ER2抗體(ti)因子單克隆

抗體(ti)樣品進行日內精(jing)密度與日間精(jing)密的分析見圖2。數(shu)據表明(ming)流動(dong)相在放置10天(tian)后仍然有(you)非常好的日(ri)內精密度(du)與日(ri)間(jian)精密度(du)：[保留(liu)時間(jian)（Time）與總峰(feng)面積(mAU)分別為圖A, C]，以區分序(xu)列間日(ri)內的(de)精(jing)密度(du)。后3份于第2日進樣(yang)一(yi)個輪次，與(yu)第1日第二輪次進樣進行日間(jian)精(jing)密度的對比（保(bao)留時間(jian)與總峰面積分(fen)別為圖B, D）。

圖2. 舟帆生物ZF-LC-0001流動相(xiang)日內精(jing)(jing)密度和日間精(jing)(jing)密度

3. 數據準確(que)性(xing)高

使用ZF-LC-0001分析重組抗人ER2抗體因子單克隆(long)抗體8個進樣量梯度的(de)過程(cheng)，R2=0.9999，數據表(biao)明(ming)，在儀器(qi)最大分(fen)析限度(du)內(nei)，進樣(yang)梯度(du)的(de)變化對數據的(de)準確(que)性影響較小。

圖3. 舟帆生物ZF-LC-0001流動相線性及進(jin)樣量與總峰面積數據

4. 廣泛的(de)樣品(pin)兼容性

使用ZF-LC-0001分(fen)析了5個(ge)單克隆抗體與2個抗(kang)體偶聯藥(yao)物的分子排阻(zu)色譜，我們將(jiang)7個蛋(dan)白藥物全部使用純水(shui)稀(xi)釋至1mg/mL，統一進樣，結(jie)果如(ru)圖(tu)4所示(shi)，表明了ZF-LC-0001流動相無論(lun)在一般的(de)(de)單(dan)克隆抗(kang)體(ti)藥(yao)物(wu)或是疏(shu)水性較強(qiang)的(de)(de)抗(kang)體(ti)偶聯藥(yao)物(wu)中均可以達到普適性分析的(de)(de)效果(guo)，并且對于低(di)濃度(du)進樣(yang)，蛋白聚集(ji)體(ti)與單(dan)體(ti)仍然顯示出極好(hao)的(de)(de)分離度(du)和分辨率。

圖4. 5種單克隆抗體(ti)與2種抗體偶(ou)聯藥(yao)物在低濃(nong)度下進樣的SEC色譜圖(tu)

5. 改善分析圖譜

除(chu)此之外，與常規(gui)流動相(xiang)比，使(shi)用ZF-LC-0001能獲得更加完美的峰形，如圖5所示，峰寬更(geng)窄，拖尾得到改善，這樣可有(you)效避免為減少拖尾向流動相中加(jia)入(ru)有(you)機溶劑，從而進一(yi)步(bu)避免(mian)溶液鹽析(xi)堵塞分析(xi)系統，造成序列意外終止(zhi)的風險。

圖5. 使用ZF-LC-0001與常規(gui)高鹽流動相的SEC色譜圖(tu)對比（樣(yang)品分別為2種mAb與2種ADC藥(yao)物）

綜上所述，舟帆生物新推出的(de)SEC-HPLC通用(yong)流動相（貨號：ZF-LC-0001）具有以下(xia)突出優(you)勢：

• 卓越的抗(kang)菌能力，有效保(bao)護貴(gui)重儀器與高價值耗(hao)材不(bu)會在分(fen)析過程中受(shou)損；
• 優異的(de)穩定性，在分(fen)析條件(jian)下放置10天(tian)后(hou)仍能達(da)到令人滿意的日內和(he)日間(jian)穩定性(xing)與可觀的線性(xing)數據；
• 廣泛的(de)樣品兼(jian)容性，適用于(yu)分析單抗、ADC、重(zhong)組(zu)蛋(dan)白與多(duo)肽（此部分數(shu)據未(wei)展示）等(deng)多(duo)種蛋(dan)白類(lei)藥物；
• 改善圖譜峰型(xing)，優化拖尾問題；
• 使(shi)用方便，對人體(ti)無毒害(hai)且環境友好。

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參考(kao)文(wen)獻：

Liu JZ, Li L, Fang WJ*. A novel size exclusion chromatography method for the analysis of monoclonal antibodies and antibody-drug conjugates by using sodium iodide in the mobile phase. Pharm Res, 2024, in press.